操作问题指南

使用新的检测缓冲液。

避免使用含叠氮化钠的缓冲液，叠氮化钠可能淬灭 HRP 信号。

延长一抗的孵育时间或在4℃下过夜孵育。

不得过度洗涤薄膜 - 过度洗涤可能洗去一抗。尝试洗涤 3 次，每次 5 分钟。

脱脂牛奶可能掩蔽抗原。尝试减少封闭液和抗体溶液中的牛奶量，或用不同的封闭液替代，比如BSA。

优化转膜条件（如时间、电流）。实施下一个步骤之前，重新确认转膜程序是否完全。

使用新鲜的抗体溶液以获得最佳性能。

使用在一抗同种寄主的二抗孵育。采用阳性对照，用以确保二抗正常起效。

采用更高的抗体浓度。我们的方案中提供了关于抗体稀释的指南。采用阳性对照，用以确保一抗正常起效。

尝试使用最为灵敏的检测试剂。

提高在凝胶上养孔加入的样本量 每孔使用 25-50μg 细胞/组织溶解物蛋白质。每孔至少加载 25μg 细胞溶解物蛋白质。

使用蛋白酶抑制剂以改善相关情况。

搜索与目标蛋白质表达相关的信息。

搜索相关文件或使用某些用于修饰预测的生物信息学分析技术。

缩短二抗孵育时间或降低抗体浓度。为二抗设置一个凝胶上样孔，仅用作对照。

缩短暴露时间。

增加 PBS 洗涤次数，以除去无用的残余抗体。

延长封闭时间或4℃下封闭过夜。

向洗涤缓冲液中添加 Tween 20（洗涤剂）或尝试不同的封闭液。

延长封闭时间。向封闭液中添加 5% 脱脂奶粉和 Tween 20。

进一步稀释抗体浓度或缩短孵育时间。

选择针对一抗同种寄主 IgG 的二抗。

延长抗体孵育时间。

尝试使用更高浓度的一抗并延长孵育时间

检查与目标蛋白质组织专属性相关的信息。使用最为灵敏的检测试剂。

使用适宜的抗原修复方法，去除福尔马林固定破坏已形成的蛋白质交联结构。

更换二甲苯溶液并延长样本脱蜡时间。

与抗体一同孵育前，用荧光显微镜检查组织切片。如检测到荧光信号，则选择其他检测系统，不得使用荧光法。

如使用生物素-抗生物素蛋白系统，用非结合抗生物素蛋白进行组织样本预处理。

如使用 AP 作为标记，用左旋咪唑溶液进行组织样本预处理。

与一抗一同孵育前，组织样品用 3% H2O2 进行预处理。

为二抗单独设置一个对照切片。

降低抗体浓度。

降低抗体浓度。

尝试缩短孵育时间，以防止信号过度显色。

添加底物后，立即将平板置于暗处。

使用新的平板。

使用新鲜的底物试剂。

延长封闭时间或使用更多封闭液或不同的封闭液。

可能被其它样本或试剂污染。防止上样孔间发生溢流。仔细移液。

确保上样孔被洗涤缓冲液充满，并确保完全除去每个上样孔中的残留溶液。增加洗涤次数。

确保设置正确的波长用于检测信号。

优化孵育时间，直至平板显色程度足以进行 ELISA 读数。

尝试使用浓度更高的抗体。孵育抗体时采用推荐的孵育时间。

搜索与目标蛋白质表达特征相关的信息。增加样本用量或使用更为灵敏的检测试剂。

仔细加入样本，避免上样孔中出现气泡。

检查涂抹程序，使用适宜的 ELISA 平板。

使用 PBS 轻柔地洗涤切片。不要长时间浸泡在洗涤缓冲液中，或用蒸馏水冲洗。

尝试不同的样本固定方法，如福尔马林或戊二醛。甲醇可能导致细胞膜破裂。

使用 0.1 Triton X-100 处理 15 分钟，以提高细胞通透性，或延长孵育时间。

将二抗储存在暗处。

确保二抗对一抗的特异性。

缩短封闭时间。

尝试使用样本中的更多细胞或使用稳定转染的细胞系。

制备细胞提取液，用蛋白质印迹法检查是否存在目标蛋白质。

延长孵育时间。

建议采用更高的浓度。

每个步骤结束时，用 PBS 彻底洗涤 5 分钟并重复5 次。

样本在4℃下孵育过夜，或室温下孵育 4 小时。

检查二抗的特异结合情况。设置不含一抗的二抗对照。

缩短与主要/二抗一同孵育的时间。

稀释抗体浓度

尝试使用不同的封闭液，如 5% 山羊血清，PBS 中孵育1 小时。

缩短固定时间。