문제 해결 팁

WB
- 오래된 검출 시약 또는 기질 kit
  
  새로운 검출 buffer를 사용하십시오.
- Sodium azide 금지
  
  sodium azide를 포함한 buffer의 사용을 피하십시오. HRP 신호를 약화시킬 수 있습니다.
- 1차 항체 incubation 부족
  
  1차 항체 incubation 기간을 늘리거나 4℃에서 overnight incubation을 실시하십시오.
- membrane 과세척
  
  membrane을 과세척하지 마십시오. 과도한 세척으로 1차 항체가 떨어져 나갈 수 있습니다. 5분씩 세 번 세척하십시오.
- Blocking buffer
  
  무지방 우유가 항원을 차폐(mask)할 수 있습니다. blocking buffer 및 antibody solution에서 우유의 양을 줄이거나 다른 blocking reagent로 대체하십시오.
- 불완전한 전송
  
  전송 조건(예: 시간, 전류)을 최적화하십시오. 다음 단계로 진행하기 전에 전송 절차가 완료되었는지 확인하십시오.
- 항체 과사용
  
  최고의 성과를 위해 신선한 antibody solution을 사용하십시오.
- 호환되지 않은 2차 항체 사용
  
  1차 항체의 host species에 대항하여 배양된 2차 항체를 사용하십시오. 2차 항체가 제대로 작용할 수 있도록 positive control을 사용하십시오.
- 1차 항체 부족
  
  높은 농도의 항체를 사용하십시오. 당사의 프로토콜은 항체 희석에 대한 지침을 제공합니다. 1차 항체가 제대로 작용할 수 있도록 positive control을 사용하십시오.
- 어려운 타겟 단백질 존재
  
  감도가 가장 높은 검출 시약을 사용해 보십시오.
- gel에 단백질 로딩 부족
  
  gel loading을 위한 샘플 양을 늘리십시오 . lane 당 25-50ug cell/tissue lysate 단백질을 사용하십시오. lane 당 최소 25ug cell lysate 단백질을 loading 하십시오.
- 단백질 degradation 또는 digested
  
  상태를 개선하기 위해 protease inhibitor를 사용하십시오.
- 다른 splice variants
  
  타겟 단백질의 발현에 관련된 정보를 검색하십시오.
- 단백질 modification
  
  관련 문서를 검색하거나 modification 예측을 위한 bioinformatic tool을 사용하십시오.
- 2차 항체 농도가 너무 높음
  
  incubation 기간 또는 항체의 농도를 줄이십시오. 2차 항체가 있는 lane을 control로만 실행하십시오.
- 과다 노출
  
  노출 시간을 줄이십시오.
- 세척 부족
  
  PBS로 세척 횟수를 늘려 원치 않는 잔여 항체를 제거하십시오.
- blocking 부족
  
  blocking 시간을 늘리거나 4℃에서 overnight blocking을 실시하십시오.
- blocking reagent와 항체 사이의 교차 반응
  
  Tween 20(세척제)을 washing buffer에 추가하거나 다른 blocking buffer를 시도하십시오.
- 항체의 Non-specific binding
  
  blocking incubation 기간을 늘리십시오. 5% 탈지 분유와 Tween 20을 blocking buffer에 추가하십시오.
- 항체의 농도가 너무 높음
  
  항체 농도를 더 희석하거나 incubate 시간을 줄이십시오.
IHC
- 항체의 농도가 너무 높음
  
  항체의 농도를 낮추십시오.
- 호환되지 않는 2차 항체
  
  1차 항체가 배양된 host species의 IgG에 대항하는 2차 항체를 선택하십시오.
- 항체 incubation 시간 부족
  
  incubation 시간을 늘리십시오.
- 단백질 검출을 위한 항체의 양 부족
  
  좀 더 긴 incubation 시간과 좀 더 높은 농도의 1차 항체를 사용해 보십시오.
- 샘플에 있는 타겟 단백질의 양 부족
  
  타겟 단백질의 조직 특이성에 관련된 정보를 확인하십시오. 감도가 가장 높은 검출 시약을 사용하십시오.
- 차폐된 항원
  
  formalin fixation으로 형성된 단백질 교차결합(cross-link)을 끊는 적합한 항원 검색 방식을 사용하십시오.
- 탈파라핀 부족
  
  xylene 용액을 refresh하고 샘플 부분을 좀 더 오랫동안 탈파라핀(deparaffinize)하십시오.
- 조직에 Autofluorescence 또는 natural fluorescence 존재
  
  항체로 incubating하기 전에 형광 현미경으로 조직 슬라이드를 확인하십시오. fluorescence 신호가 검출되면 fluorescent 방식이 아닌 다른 검출 시스템을 선택하십시오.
- Endogenous biotin 신호
  
  biotin-avidin 검출 시스템을 사용하는 경우에는 unconjugated avidin으로 조직 샘플을 사전 처리하십시오.
- Endogenous alkaline phosphatase 활동
  
  AP를 표지로 사용하는 경우에는 levamisole 용액으로 조직 샘플을 사전 처리하십시오.
- Endogenous peroxidase 활동
  
  1차 항체로 조직 샘플을 incubating하기 전에 3% H2O2로 조직 샘플을 사전 처리하십시오.
- 2차 항체의 Non-specific binding
  
  2차 항체만으로 control lane을 실행하십시오.
ELISA
- 기질 Over incubation
  
  신호 over-development를 방지하기 위해 incubation 시간을 줄여보십시오.
- 조명 아래에서 기질 incubation 실시
  
  기질을 추가한 후 즉시 플레이트를 어두운 곳에 두십시오.
- 재사용 플레이트
  
  새 플레이트를 사용하십시오.
- 오래된 기질 buffer
  
  신선한 기질 시약을 사용하십시오.
- 항체 농도가 너무 높음
  
  항체의 농도를 낮추십시오.
- blocking 시간 부족
  
  blocking 시간을 늘리거나 더 많은/다른 blocking 용액을 사용하십시오.
- negative control 오염
  
  다른 샘플이나 시약에 오염되었을 수 있습니다. well이 넘치지 않게 하십시오. Pipetting에 유의하십시오.
- 플레이트의 세척 횟수 부족
  
  well에 wash buffer를 채우고 각 well에서 잔여 용액이 완전히 제거되었는지 확인하십시오. 세척 횟수를 늘리십시오.
- 올바르지 않은 파장
  
  신호를 측정할 올바른 파장이 설정되었는지 확인하십시오.
- 기질 용액의 incubation 시간 부족
  
  플레이트가 ELISA 리더에 충분하게 개발될 때까지 incubation 시간을 최적화하십시오.
- 사용된 항체 부족
  
  더 높은 농도의 항체를 사용해 보십시오. 항체를 권장된 시간동안 Incubate하십시오.
- 샘플에서 타겟 단백질이 발현되지 않음
  
  타겟 단백질의 발현 프로파일에 관련된 정보를 검색하십시오. 사용된 샘플의 양을 늘리거나 감도가 높은 검출 시약을 사용하십시오.
- Pipetting 오류
  
  샘플을 로딩할 때 주의하여 well 안에 기포가 생기지 않도록 하십시오.
- 코팅 불균일
  
  코팅 절차를 확인하고 적합한 ELISA 플레이트를 사용하십시오.
IF
- 세척 부족
  
  PBS를 사용하여 슬라이드를 부드럽게 세척하십시오. wash buffer에 장시간 담그거나 증류수를 뿌리지 마십시오.
- 샘플 fixation에 의한 epitope 파괴
  
  formalin이나 glutaraldehyde와 같은 다른 샘플 fixation 방식을 사용해 보십시오. Methanol은 cell membrane을 붕괴시킬 수 있습니다.
- Cell permeability 불량
  
  cell을 투과하기 위해 0.1 Triton X-100을 15분동안 사용하거나 incubation 시간을 늘리십시오.
- 2차 항체 조명에 노출
  
  2차 항체를 어두운 곳에 보관하십시오.
- 사용된 2차 항체 부족
  
  2차 항체가 1차 항체에 대응하는지 확인하십시오.
- Blocking이 너무 강함
  
  blocking 시간을 줄이십시오.
- 단백질을 발현하는 cell이 너무 적음
  
  샘플에 더 많은 cell을 사용하거나 안정적으로 transfect된 cell line을 사용해 보십시오.
- 단백질이 cell에 발현되지 않음
  
  cell 추출을 준비하고 Western blot으로 타겟 단백질이 cell에 나타나는지 확인하십시오.
- 항체 incubation 시간이 너무 짧음
  
  incubation 시간을 늘리십시오.
- 항체 농도가 너무 희석됨
  
  더 높은 농도를 권장합니다.
- 샘플 세척 부족
  
  각 단계의 끝에 PBS로 5분간 깨끗이 세척하십시오. 5번을 반복하십시오.
- Incubation 온도가 너무 높음
  
  4℃에서 overnight incubate 또는 실온에서 4시간 동안 incubate하십시오.
- 2차 항체가 분명하지 않음
  
  2차 항체가 특정적으로 결합하는지 확인하십시오. 1차 항체 없이 2차 control을 실행하십시오.
- Incubation 기간이 너무 길다
  
  1차/2차 항체 Incubate 시간을 줄이십시오.
- 1차 항체의 농도가 너무 높음
  
  항체 농도를 희석하십시오.
- 올바르지 않은 blocking buffer 사용
  
  PBS에 5% goat serum과 같이 다른 blocking buffer를 1시간 동안 사용해 보십시오.
- 테스트 샘플의 Overfixation
  
  fixation 시간을 줄이십시오.