Tipps zur Problembehandlung

Verwenden Sie neue Detektionspuffer.

Vermeiden Sie Puffer mit Natriumazid, das HRP-Signale stillen kann.

Erhöhen Sie die Inkubationszeit mit dem primären Antikörper oder führen Sie die Inkubation über Nacht bei 4℃ durch.

Die Membran nicht überwaschen - übermäßiges Waschen kann den primären Antikörper wegwaschen. Versuchen Sie dreimaliges Waschen von 5 Minuten.

Fettfreie Milch kann Antigene maskieren. Versuchen Sie, die Milchmenge im Blockierungspuffer und der Antikörperlösung zu reduzieren oder ersetzen sie mit verschiedenen Blockierungsreagenzien.

Optimieren Sie die Übertragungsbedingungen (z.B. Zeit, elektrischer Strom). Stellen Sie sicher, dass die Übertragung abgeschlossen ist, bevor sie mit der nächsten Stufe fortfahren

Verwenden Sie eine frische Antikörper-Lösung für eine optimale Leistung.

Verwenden Sie einen sekundären Antikörper, der gegen die Wirtsspezies des primären Antikörpers gezogen wurde. Verwenden Sie positive Kontrollen, um sicherzustellen, dass der sekundäre Antikörper richtig arbeitet.

Verwenden Sie höhere Konzentrationen des Antikörpers. Unser Protokoll bietet einen Leitfaden für die Antikörperverdünnung. Verwenden Sie positive Kontrollen, um sicherzustellen, dass der primäre Antikörper richtig arbeitet.

Versuchen Sie, die empfindlichste Nachweisreagenz zu verwenden.

Erhöhen Sie die Menge der Probe für die Gelladung. Verwenden 25-50ug Zelle/Gewebelysat Protein pro Bahn. Laden Sie mindestens 25ug Zelllysat Protein pro Bahn.

Verwenden Sie Protease-Inhibitoren, um den Zustand zu verbessern.

Suchen Sie nach Informationen in Bezug auf die Expression des Zielproteins.

Suchen Sie verwandte Dokumente oder nutzen Sie bioinformatische Werkzeuge zur Modifikationsvorhersage.

Verringern Sie die Inkubationszeit oder die Konzentration des Antikörpers. Führen Sie eine Bahn nur mit dem sekundären Antikörper als Kontrolle durch.

Verringern Sie die Belichtungszeit.

Erhöhen Sie die Anzahl von Waschgängen mit PBS, um unerwünschte Rest-Antikörper zu entfernen.

Verlängern Sie die Blockierungszeit oder führen Sie eine Blockierung über Nacht bei 4℃ aus.

Fügen Sie Tween 20 (Reinigungsmittel) zum Waschpuffer hinzu oder probieren Sie verschiedene Blockierungspuffer.

Erhöhen Sie die Blockierungs-Inkubationszeit. Fügen Sie 5% fettfreies Milchpulver und Tween 20 zum Blockierungspuffer hinzu.

Verdünnen Sie die Antikörperkonzentration weiter oder inkubieren Sie kürzer.

Wählen Sie einen sekundären Antikörper, der gegen das IgG der Wirtsspezies ist, in dem der primäre Antikörper gezogen wurde.

Verlängern Sie die Inkubationszeit.

Versuchen Sie, höhere Konzentrationen des Primärantikörpers mit einer längeren Inkubationszeit zu verwenden

Prüfen Sie die Informationen in Bezug auf die Gewebespezifität des Zielproteins. Verwenden Sie die empfindlichste Nachweisreagenz.

Verwenden Sie eine geeignete Antigen-Retrieval-Methode, um die durch Formalinfixierung gebildeten Protein-Quervernetzungen zu brechen.

Frischen Sie die Xylollösung auf und entparaffinieren Sie die Probenabschnitte über einen längeren Zeitraum.

Überprüfen Sie die Geweberutsche durch ein Fluoreszenzmikroskop vor der Inkubation mit dem Antikörper. Falls das Fluoreszenzsignal erfasst wird, wählen Sie andere Detektionssysteme, nicht das Fluoreszenzverfahren.

Behandeln Sie die Gewebeprobe mit nichtkonjugiertem Avidin vor, wenn das Biotin-Avidin-Nachweissystem verwendet wird.

Behandeln Sie die Gewebeprobe mit Levamisol Lösung vor, wenn AP als Bezeichnung verwendet wird.

Behandeln Sie die Gewebeprobe mit 3% H2O2 vor der Inkubation mit dem primären Antikörper vor.

Führen Sie eine Bahn der Kontrolle nur mit dem sekundären Antikörper durch.

Verringern Sie die Antikörperkonzentration.

Verringern Sie die Inkubationszeit, um eine Signalüberentwicklung zu verhindern.

Legen Sie die Platte nach der Zugabe von Substrat sofort ins Dunkle.

Verwenden Sie eine neue Platte.

Verwenden Sie frische Substratreagens.

Verringern Sie die Konzentration des Antikörpers.

Verlängern Sie die Blockierzeit oder benutzen Sie mehrere/verschiedene Blockierungslösungen.

Kann durch andere Proben oder Reagenzien kontaminiert sein. Vermeiden Sie ein Überlaufen der Vertiefungen. Pipettieren Sie sorgfältig.

Stellen Sie sicher, dass Vertiefungen mit Waschpuffer gefüllt sind und sorgen Sie für die vollständige Entfernung der restlichen Lösung aus jeder Vertiefung. Erhöhen Sie die Anzahl der Waschgänge.

Stellen Sie sicher, dass die korrekte Wellenlänge zur Messung des Signals eingestellt ist.

Optimieren Sie die Inkubationszeit, bis die Platte genug für ELISA-Reader entwickelt ist.

Versuchen Sie, mehr konzentrierte Antikörper zu verwenden. Inkubieren Sie den Antikörper für die empfohlene Zeitdauer

Suchen Sie nach Informationen in Bezug auf das Expressionsprofil des Zielproteins. Erhöhen Sie die Menge der eingesetzten Probe oder verwenden Sie empfindlichere Nachweisreagenzien.

Seien Sie vorsichtig bei der Probenbeladung und vermeiden Sie die Anwesenheit von Blasen in den Vertiefungen.

Überprüfen Sie das Beschichtungsverfahren und verwenden Sie geeignete ELISA-Platten.

Probieren Sie ein Probenfixierungsverfahren wie Formalin oder Glutaraldehyd. Methanol kann dazu führen, dass die Zellmembran kollabiert.

Benutzen Sie 0,1 Triton X-100 für 15 min, um Zellen zu permeabilisieren oder erhöhen Sie die Inkubationszeit.

Waschen Sie die Platten vorsichtig mit PBS. Nicht über lange Zeiträume in Waschpuffer tauchen oder mit destilliertem Wasser begießen.

Bewahren Sie die sekundären Antikörper im Dunkeln auf.

Stellen Sie sicher, dass der sekundäre Antikörper spezifisch für primäre Antikörper ist.

Verkürzen Sie die Blockierungszeit.

Versuchen Sie, mehr Zellen in Proben oder eine stabil transfizierte Zelllinie zu verwenden.

Bereiten Sie einen Zellextrakt vor und prüfen Sie durch Western-Blots, ob das Zielprotein in Zellen vorhanden ist.

Verlängern Sie die Inkubationszeit.

Eine höhere Konzentration wird empfohlen.

Gründlich mit PBS am Ende jeder Stufe 5 Minuten lang waschen. Wiederholen Sie den Vorgang 5 Mal.

Inkubieren Sie Proben bei 4℃ über Nacht oder 4 Stunden lang bei Zimmertemperatur.

Überprüfen Sie, ob der sekundäre Antikörper spezifisch bindet. Führen Sie eine Sekundärkontrolle ohne primären Antikörper durch.

Inkubieren Sie mit primären/sekundären Antikörper für eine kurze Zeit.

Verdünnen Sie die Antikörperkonzentration.

Versuchen Sie, einen anderen Blockierungspuffer, z.B. 5% Ziegenserum in PBS 1 Stunde lang zu verwenden.

Verringern Sie die Fixierungszeit.